品圖片-網(wǎng)頁展示/產(chǎn)品圖片-網(wǎng)頁展示2/無內(nèi)毒素大提試劑盒.png)
產(chǎn)品編號： BLGE059
產(chǎn)品規(guī)格： 10T
| 組分編號 | 產(chǎn)品組成 |
BLGE059 (10T) |
| BLGE299-30ML | 平衡液BL (Buffer BL) | 30 mL |
| BLGE300-100ML | 溶液P1 (Buffer P1) | 100 mL |
| BLGE301-100ML | 溶液P2 (Buffer P2) | 100 mL |
| BLGE302-100ML | 溶液P4 (Buffer P4) | 100 mL |
| BLGE303-70ML | 漂洗液PW (Buffer PW) | 70 mL |
| BLGE304-30ML | 洗脫緩沖液TB (Buffer TB) | 30 mL |
| BLGE305-500UL | RNA酶A(RNase A (100 mg/mL)) | 500 μL |
| BLGE306-10pcs | 過濾器CS1 (Filtration CS1) | 10個 |
| BLGE307-10pcs | 吸附柱CP6 (Spin Columns CP6) | 10個 |
| BLGE308-20pcs | 收集管(50 ml) (Collection Tubes (50 ml)) | 20個 |
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說明書 |
產(chǎn)品情況：本試劑盒采用獨(dú)特的硅膠膜吸附技術(shù)，高效專一地結(jié)合質(zhì)粒DNA。同時采用特殊的溶液
P4和過濾器CS1，可有效的去除內(nèi)毒素、蛋白等雜質(zhì)；整個提取過程僅需1h，方便快捷。
推薦過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液使用量為：高拷貝質(zhì)粒推薦使用量為100 mL，得率一般在500 - 1500μg左右；低拷貝質(zhì)粒推薦使用量為200 mL，得率一般在200 - 600 μg左右。質(zhì)粒的提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類、培養(yǎng)條件、菌體裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、抗生素等因素有關(guān)。
使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)。
儲存運(yùn)輸：常溫運(yùn)輸；
試劑盒在15 - 25℃干燥室溫條件下，可保存12個月；
試劑盒在2 - 8℃條件下可保存更長時間，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前于37℃溶解沉淀；
單獨(dú)包裝的RNaseA在室溫可穩(wěn)定保存12個月以上；
加入RNaseA的溶液P1在2 - 8℃條件下可穩(wěn)定保存6個月。
注意事項(xiàng)：
（一）溶液P1在使用前先加入全部的RNase A 并混勻，放入2 - 8℃保存；
（二）第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說明，先在漂洗液PW中加入無水乙醇；
（三）使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P4是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清；
（四）實(shí)驗(yàn)前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率。但用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時間過長會影響使用效果；
（五）注意不要直接接觸溶液P2和P4，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子；
（六）使用過濾器時請將推柄小心緩慢地從過濾管中抽出，避免濾膜因壓力而松動；
（七）提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脫緩沖液推薦在65 - 70℃水浴中預(yù)熱?？梢赃m當(dāng)延長吸附和洗脫時間，以提高提取效率。
實(shí)驗(yàn)流程：
注意：
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說明先在溶液P1中加入全部的RNase A；
第一次使用前應(yīng)按照瓶簽說明先在漂洗液PW中加入無水乙醇。
（一）步驟1
加2.5 mL的平衡液BL至吸附柱CP6中（吸附柱放入50mL收集管中），8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：用平衡液處理過的柱子最好立即使用，放置時間過長會影響使用效果。
（二）步驟2
取100 mL（根據(jù)培養(yǎng)的菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200 mL）過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，室溫，8,000 rpm (~8,228×g)離心3 min收集細(xì)菌，盡量吸除上清。
注意：
（1）可以通過多次離心的方法將較多菌液的菌體沉淀收集到一個離心管中, 菌體量以保證充分裂解為宜，避免過多的菌體導(dǎo)致的裂解不充分，從而降低質(zhì)粒的提取效率。
（2）盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。
（三）步驟3
加8 mL溶液P1至留有菌體沉淀的離心管中（請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。
注意：充分懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。對于低拷貝質(zhì)粒，加大菌體用量的同時按比例增加P1、P2、P4的用量。
（四）步驟4
加8 mL溶液P2至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次，使菌體充分裂解，室溫放置5 min。
注意：混合時務(wù)必溫和，以免發(fā)生基因組DNA污染。混合后菌液應(yīng)變得清亮粘稠，裂解時間控制在5 min內(nèi)，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變清亮，可能由于菌體過多，導(dǎo)致裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
（五）步驟5
加8 mL溶液P4至離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 - 8次以充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置10 min左右。8,000 rpm (~8,228×g)離心5 - 10 min，使白色沉淀離至管底（可適當(dāng)增加離心時間），將全部溶液小心（緩慢的）倒入過濾器CS1中（請避免倒入大量沉淀而阻塞過濾器），慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50 mL的管中（自備）。
注意：加入溶液P4后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離心后倒入過濾器CS1中的溶液有白色沉淀也不會影響過濾。如果菌體過多（>100 mL），推薦延長離心時間至20 - 30 min。
（六）步驟6
加入0.3倍濾液體積的異丙醇至濾液中，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50 mL收集管中）。
注意：過濾后濾液會損失，根據(jù)損失的不同請加入不同體積的異丙醇，加入異丙醇過多容易導(dǎo)致RNA污染。吸附柱CP6的最大容積為15 mL，所以需要分2次過柱。個別情況下離心機(jī)角轉(zhuǎn)子傾角較大，此時，建議加入吸附柱CP6的溶液體積不超過10 mL，以防漏液。
（七）步驟7
室溫8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。
注意：將第6步中所得溶液分2次過柱，每次均按以上條件操作。
（八）步驟8
加10 mL漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇）至吸附柱CP6中，8,000 rpm
(~8,228×g)離心2 min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：重復(fù)步驟8一次。
（九）步驟9
加3 mL無水乙醇至吸附柱CP6中，室溫8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min，倒掉廢液。
（十）步驟10
將吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000 rpm (~8,228×g)離心5 min，去除吸附柱中殘余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。建議將吸附柱CP6開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，以確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響。
（十一）步驟11
將吸附柱CP6置于一個干凈的50 mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1 - 2 mL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min，然后室溫8,000 rpm (~8,228×g)離心2 min。將50 mL離心管中的洗脫液全部移入一個干凈的1.5 mL離心管，-20℃保存。
注意：可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟11，以增加質(zhì)粒的回收效率。若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.5 - 8.0范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率，洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。洗脫液用量的多少主要是根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實(shí)驗(yàn)所需要的濃度來確定。洗脫液體積不少于1 mL，體積過小會影響回收效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防降解。
（十二）步驟12（可選步驟）
加1.42 mL異丙醇以及0.42 mL 5mol/L的 NaCl (自備)至每1 mL洗脫液中，混勻，室溫放置5 min，8,000 rpm (~8,228×g)離心10 min，小心棄上清。
（十三）步驟13（可選步驟）
加入0.5 mL 的70%乙醇洗滌沉淀, 室溫 8,000 rpm (~8,228×g)離心5 min，小心棄乙醇。
注意：重復(fù)步驟13一次。
（十四）步驟14（可選步驟）
空氣中干燥沉淀約5 - 10 min, 根據(jù)需要用適當(dāng)體積的TB緩沖液溶解沉淀。
質(zhì)量檢測
（一）可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測得到的質(zhì)粒濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/mL 雙鏈DNA。純化的質(zhì)粒 OD260/OD280通常在1.8 - 2.0左右，可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對質(zhì)粒純度要求很高的實(shí)驗(yàn)中。
（二）如果洗脫時使用去離子水而不使用洗脫緩沖液，OD260/OD280比值會偏低，但并不表示純度低，因?yàn)閜H值和離子的存在會影響光吸收值。
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷！