噬菌體展示技術(shù)篩選納米抗體
1. 納米抗體簡介
1993年，Hamers-Casterman教授以及他的同事們在駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)了一種與傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)不同的新型抗體：缺失輕鏈的天然重鏈抗體的可變區(qū)組成的單域抗體，該抗體只包含一個重鏈可變區(qū)（VHH）和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，分子量只有15KD，是傳統(tǒng)抗體的十分之一左右，是抗原結(jié)合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被稱作納米抗體。
由于沒有輕鏈，納米抗體僅有3個屬于重鏈的抗原識別區(qū)域（CDRs 區(qū)）。為了彌補缺少的輕鏈CDRs的生物學(xué)活性，納米抗體在 CDR3部分增加了氨基酸長度（16~18個氨基酸殘基，對應(yīng)的傳統(tǒng)抗體的CDR3有8-15個氨基酸），以增加CDR的多樣性和特異性。另外，納米抗體的 CDR3 區(qū)域可形成一個大的暴露的凸環(huán)，像“手指”一樣延伸到抗原的縫隙或者裂口中，可以接觸到傳統(tǒng)抗體不能接觸的抗原表位。CDR3凸環(huán)中的一個半胱氨酸還可以與CDR1 或FR2 的 45 位點的半胱氨酸形成二硫鍵，可使納米抗體的生物結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，大大降低納米抗體與抗原結(jié)合所需能量，使得高親和力的納米抗體的獲得較容易。
2. 噬菌體展示原理
將待篩選基因插入噬菌體信號肽序列與主要衣殼蛋白基因VIII或基因III之間，每一個噬菌體只含有一個外源基因，每一個噬菌體只表達一種外源肽或蛋白，且呈現(xiàn)在噬菌體表面，而且不影響噬菌體的完整性。利用展示的多肽與目的蛋白（主要是抗體、抗等）或其他生物大分子親和的性質(zhì)可高效率地篩選出特異多肽。親和篩選的關(guān)鍵在于靶蛋白與短肽間的特異性結(jié)合，為了增加篩選的特異性，在篩選的過程中都是不斷地降低篩選配基的濃度，從而保證被篩選得到的短肽與靶蛋白有較強的親和力，即它們的結(jié)合是特異性的。
3. 納米抗體制備方案
納米抗體的獲得現(xiàn)在基本通過免疫羊駝，從羊駝體內(nèi)自身的抗體成熟階段來得到抗體基因，通過噬菌體展示篩選技術(shù)來從羊駝抗體庫中篩選得到高親和力的抗體序列。整個過程主要包括三個階段：
羊駝免疫：
一只羊駝可以同時免疫1-5個抗原，每次免疫總的抗原量保持在1-2mg之間，體積在2mL以下，純化制備的抗原與佐劑進行乳化后對羊駝進行免疫。在每次免疫前進行采血用于免疫評價，采血從羊駝頸部靜脈采取。
噬菌體文庫構(gòu)建：
分離免疫后的羊駝外周血單個核細胞，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫，據(jù)設(shè)計的引物在cDNA文庫中擴增得到VHH片段。通過將抗體基因克隆到相應(yīng)噬菌體載體上可以將外源基因插入噬菌體基因適當(dāng)位置并隨著隨著噬菌體傳代，最終使外源蛋白展現(xiàn)在子代噬菌體的表面。
納米抗體篩選：
篩選的方法主要分為固相篩選和液相篩選兩種。通過生物淘洗法、競爭法、消減法、選擇性感染篩選、延遲性感染篩選等方法可以對和靶蛋白強力結(jié)合的基因片段篩選出來。將靶點抗原或者帶有抗原的物質(zhì)直接/間接的固定在固體載體上，隨后加入噬菌體文庫和抗原相互作用。作用一段時間后用洗滌液洗滌固體載體表面，可以將未結(jié)合或非特異結(jié)合的噬菌體洗去。隨后用強酸或者強堿破壞固體載體上抗原和陽性噬菌體的結(jié)合，從而得到陽性噬菌體溶液。將其侵染大腸桿菌進、鋪盤、表達后進行ELISA鑒定，一般重復(fù)進行2-3輪的篩選即可獲得高親和力的納米抗體克隆。