實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)問(wèn)題分析匯總
合成的DNA保存：干燥制品很穩(wěn)定，-20℃下可保存2年；溶解后的DNA于-20℃保存，最好是分份保存，避免反復(fù)凍融；溶液中的Oligo DNA在常溫下可放置3～4天。
合成的RNA保存：干燥制品存放于-80℃最好，-20℃下可保存2年；溶液狀態(tài)的RNA最好保存在-80℃，如無(wú)條件，也要保存于-20℃。
對(duì)合成DNA/RNA制品進(jìn)行定量：由于核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，因此常根據(jù)此性質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸溶液在260 nm的吸光度值，據(jù)此對(duì)核酸進(jìn)行定量，用OD值來(lái)表示。1個(gè)OD值的合成DNA/RNA的質(zhì)量約為33μg。將DNA/RNA溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)刮舛葴y(cè)定值與樣品濃度的關(guān)系在直線(xiàn)范圍內(nèi)，再根據(jù)原溶液的總體積與稀釋倍數(shù)計(jì)算該溶液的總OD值。
OD260/OD280<1.8：由于核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280 nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時(shí)，常用OD260/OD280比值來(lái)評(píng)價(jià)核酸純度 (比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時(shí)的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個(gè)堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同，例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時(shí)，該比值會(huì)大大低于1.8。此外，序列中堿基的排列順序也影響該比值。所以不能根據(jù)OD260/OD280比值來(lái)評(píng)價(jià)合成DNA/RNA制品的純度。
引物修飾常見(jiàn)問(wèn)題分析
引物修飾：常見(jiàn)的引物修飾包括有磷酸化（Phosphorylation）、生物素（Biotin）、地高新（Digoxigenin）、內(nèi)部氨基修飾、5'氨基修飾、3'氨基修飾、巰基（Thiol）、硫代（Phosphorthioate）、脫氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）和脫氧次黃嘌呤（deoxyInosine，dI）等。
合成的熒光標(biāo)記探針保存：熒光探針必須避光保存；干品可于-80℃保存一年以上，無(wú)條件時(shí)可于-20℃保存；用RNase-free的TE（pH 8.0）buffer溶解探針，得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)；避免反復(fù)凍融。
熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析
SYBR-Green染料法與TaqMan熒光探針?lè)?/strong>：SYBR-Green染料法：染料能夠與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)PCR擴(kuò)增的時(shí)候，染料能特異性地滲入結(jié)合到DNA雙鏈上，發(fā)射熒光信號(hào)，而沒(méi)有滲入的染料分子不會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，從而通過(guò)收集到的熒光信號(hào)，確定PCR產(chǎn)物的增加量。染料法特異性不強(qiáng)，只要是雙鏈DNA都可以發(fā)光，所以該方法適用于任何DNA，無(wú)需設(shè)計(jì)探針，采取雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，實(shí)驗(yàn)周期短，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高。TaqMan熒光探針?lè)ǎ篜CR擴(kuò)增時(shí)需要同時(shí)加入一對(duì)引物和一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別帶上一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，所以通過(guò)熒光信號(hào)的累積，可以監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物形成。探針?lè)ㄔO(shè)計(jì)探針對(duì)目標(biāo)基因有高特異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，相對(duì)于SYBR Green法，靈敏度更高。
熒光定量PCR需要提供的信息：樣品（組織/細(xì)胞/RNA/cDNA）、物種信息、目的基因的序列、GeneBank編號(hào)；引物、內(nèi)參基因、對(duì)照組。
對(duì)照組和內(nèi)參基因：在QPCR中加入內(nèi)參基因校準(zhǔn)，可以消除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄上可能存在的差別，從而獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。QPCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算的是相對(duì)表達(dá)量，需以指定的樣品（對(duì)照組）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析。
載體構(gòu)建常見(jiàn)問(wèn)題分析
PCR：載體構(gòu)建大部分時(shí)候都要通過(guò)PCR的方法獲取目的片段，擴(kuò)增PCR時(shí)盡量選用高保真的PCR酶來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增之前要了解目的基因序列信息，其次高質(zhì)量的模板對(duì)PCR成功與否也很重要，以質(zhì)粒作為模板的PCR相對(duì)來(lái)說(shuō)最好擴(kuò)增，基因組DNA和cDNA相對(duì)來(lái)說(shuō)較難獲取一些。
引物：引物設(shè)計(jì)中，很多軟件都可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，比如pirmer5，構(gòu)建過(guò)程中，選用哪種方法需要在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候考慮到，一般常用酶切連接的方法，但也可以使用無(wú)縫克隆的方法。需要注意的是做酶切連接引物設(shè)計(jì)要注意加上保護(hù)堿基，保護(hù)堿基大部分加入4個(gè)堿基可以滿(mǎn)足大多數(shù)內(nèi)切酶，也可以參照限制性?xún)?nèi)切酶保護(hù)堿基添加表加保護(hù)堿基。無(wú)縫克隆方法設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要加入同源重組臂序列。
菌落PCR鑒定：做菌落PCR鑒定的時(shí)候引物一般選擇載體上的通用引物來(lái)鑒定，因?yàn)檫x用目的片段兩端的引物可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；操作方法一般是在小的EP管培養(yǎng)4小時(shí)左右，挑取單克隆，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁的情況時(shí)，即可進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定完成后測(cè)序驗(yàn)證，PCR過(guò)程可能會(huì)發(fā)生突變，所以多送幾個(gè)克隆可以保證我們所要的克隆順利獲得。
抗體選擇常見(jiàn)問(wèn)題分析
一抗選擇：① 分析自己實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法。根據(jù)說(shuō)明書(shū)選擇抗體適用的分析類(lèi)型，如：可以應(yīng)用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。 ② 分析自己實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的種屬。一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種動(dòng)物或人的標(biāo)本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等動(dòng)物的標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)。 ③ 分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性。抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述， 如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FCM流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。④ 抗體宿主物種的選擇。對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。
二抗選擇：① 一抗的種屬來(lái)源。二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源。② 一抗的類(lèi)別。二抗還需與一抗的類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配，這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。③ 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記。一般來(lái)講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。
特殊抗體保存：聯(lián)抗體酶永遠(yuǎn)保存在 4℃，避免冷凍；偶聯(lián)抗體需要在棕色管中或使用錫箔紙避光4℃保存，尤其是熒光抗體，對(duì)光極為敏感；IgG3的同型對(duì)照，永遠(yuǎn)保存在4℃，避免冷凍。注意絕對(duì)避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力。
IHC常見(jiàn)問(wèn)題分析
邊緣效應(yīng)：① 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴(lài)氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。 ② 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。
產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因：① 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。② 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。 ③ 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色。④ 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果。
背景強(qiáng)的原因：考慮一抗?jié)舛雀撸徽{(diào)整DAB孵育時(shí)間；考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短；適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。
WB常見(jiàn)問(wèn)題分析
目的蛋白難顯影信號(hào)較弱：① 抗體濃度較低，需要增加抗體的濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間；② 轉(zhuǎn)膜效率低，轉(zhuǎn)膜緩沖液的pH值若與目的蛋白等電點(diǎn)相近則需要提高pH值；轉(zhuǎn)膜時(shí)是否有降溫處理；把握好轉(zhuǎn)膜的時(shí)間，電壓等； ③ ECL量不足或淬滅較快，則要提高ECL的量，并避光孵育膜。
結(jié)果背景過(guò)高：① 封閉問(wèn)題：封閉液的濃度不足，提高封閉液的濃度，封閉液需要完全覆蓋膜；封閉時(shí)間需要1小時(shí)以上，或者4℃封閉過(guò)夜。② 抗體問(wèn)題：抗體的非特異性結(jié)合，抗體濃度過(guò)高，孵育時(shí)間過(guò)久也會(huì)造成如此結(jié)果。③ 洗脫問(wèn)題：提高洗膜次數(shù)及時(shí)間。所有處理膜的過(guò)程中，切勿使膜干掉。④ 顯色時(shí)化學(xué)顯色底物過(guò)多：按說(shuō)明書(shū)加顯色底物。
結(jié)果條帶出現(xiàn)寬窄不一：① 膠制備的不好，凝膠聚合不均勻：制膠時(shí)加入TEMED后，立馬混合均勻，盡快灌膠，灌膠時(shí)從一角注膠，動(dòng)作輕緩。 ② 膠板底部確保無(wú)氣泡，有氣泡，需要趕走氣。③ 拔梳子時(shí)，將孔齒弄歪曲，或孔中殘留的膠未沖洗掉，會(huì)導(dǎo)致上樣帶扭曲。④ 電泳液過(guò)少，氣泡進(jìn)入上樣孔，增加了電阻。⑤ 上樣量一定要一致。上樣量不宜過(guò)大，上樣要迅速，否則引起樣品擴(kuò)散，容易導(dǎo)致條帶連在一起。
ChIP常見(jiàn)問(wèn)題分析
碎裂染色質(zhì)的濃度過(guò)低：染色質(zhì)制備使用的細(xì)胞或組織不夠，或細(xì)胞/組織裂解不完全，如果染色質(zhì)制備物的 DNA 濃度接近于 50 μg/ml，則向每次 IP 添加額外的染色質(zhì)，以確保每次 IP 至少產(chǎn)生 5 μg，然后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。交聯(lián)前，對(duì)單獨(dú)平板上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量。在超聲處理前后，用顯微鏡觀察細(xì)胞胞核，以確認(rèn)胞核是否完全裂解。
樣品輸入對(duì)照組 PCR 反應(yīng)中無(wú)產(chǎn)物或產(chǎn)物很少：添加至 PCR 反應(yīng)的 DNA 不足或條件不是最佳，向 PCR 反應(yīng)中添加更多 DNA 或增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。使用來(lái)源于交聯(lián)和碎裂染色質(zhì)的純化 DNA 來(lái)優(yōu)化針對(duì)實(shí)驗(yàn)用引物組的 PCR 條件；添加用于免疫沉淀的染色質(zhì)不足，或染色質(zhì)被過(guò)度碎裂，建議每次免疫沉淀添加 5–10 μg 染色質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)抗體 IP PCR 反應(yīng)中無(wú)產(chǎn)物：添加至 PCR 反應(yīng)的 DNA 不足，建議向 PCR 反應(yīng)中添加更多 DNA 或增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)；添加至 IP 反應(yīng)的抗體不足，建議增加添加至 IP 反應(yīng)的抗體量。
流式細(xì)胞術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題分析
熒光信號(hào)弱：可能的原因是處理未充分誘導(dǎo)靶標(biāo)表達(dá)，建議對(duì)每個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行成功和可測(cè)量的誘導(dǎo)，優(yōu)化處理?xiàng)l件。如果使用的是PBMC，避開(kāi)冰凍樣品，在可能的情況下，分離新鮮細(xì)胞。對(duì)照選擇未刺激/未處理的對(duì)照、同型對(duì)照、單獨(dú)細(xì)胞（未染色）對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。如果目的靶標(biāo)為胞內(nèi)靶標(biāo)，確保使用合適的固定和通透實(shí)驗(yàn)步驟。根據(jù)靶標(biāo)以及是否同時(shí)進(jìn)行表面標(biāo)記物染色，可能需要不同形式的固定和通透處理。熒光信號(hào)弱或者沒(méi)有熒光信號(hào)還要考慮熒光物質(zhì)的大小、構(gòu)象和穩(wěn)定性。
紅細(xì)胞裂解不完全：可能是0.1% Triton X-100 溶液可能不新鮮，應(yīng)使用新鮮試劑，并嚴(yán)格遵循流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟。
高背景：抗體太多時(shí)使用建議的抗體稀釋度，使用較低的細(xì)胞數(shù)時(shí)，可自行進(jìn)行滴定?？贵w染色避免使用生物素化抗體。在進(jìn)行胞內(nèi)染色時(shí)，由于使用鏈霉親和素或抗生物素二抗偶聯(lián)物檢測(cè)胞內(nèi)自然存在的內(nèi)源性生物素，這些很容易導(dǎo)致較高的背景水平。
存在死細(xì)胞：在進(jìn)行活細(xì)胞表面染色時(shí)，使用活細(xì)胞鑒定染料對(duì)死細(xì)胞設(shè)置門(mén)控。但對(duì)固定細(xì)胞完成染色時(shí)，使用可固定的活細(xì)胞鑒定染料，這種染料能經(jīng)受固定處理，可在胞內(nèi)染色時(shí)結(jié)合使用。