品圖片-網(wǎng)頁(yè)展示/產(chǎn)品圖片-網(wǎng)頁(yè)展示2/彩色熒光定量預(yù)混試劑盒（SYBR-Green）.png)
產(chǎn)品編號(hào)：BLGE146
產(chǎn)品規(guī)格：
| 產(chǎn)品組成 | BLGE146-01（125rxn） | BLGE146-02（500rxn） | BLGE146-03（2500rxn） |
| 2×PreMix (SYBR Green, blue) | 1.25ml | 4×1.25ml | 5×BLGE146-02 |
| 50×ROX Reference Dye | 250µl | 1ml | 5×BLGE146-02 |
| 40×Dilution Buffer (Yellow) | 1.25ml | 1.25ml | 5×BLGE146-02 |
| RNase-Free ddH2O | 2×1ml | 5×1ml | 5×BLGE146-02 |
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說明書 |
產(chǎn)品情況：Color PreMix Kit(SYBR Green)試劑盒選用Real Time PCR專用試劑進(jìn)行SYBR Green I 嵌合熒光法qPCR反應(yīng)，核心成分為高效化學(xué)修飾、新型抗體法制備、耐熱Taq DNA聚合酶。為充分發(fā)揮熱啟動(dòng)酶特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，本品配套改良了緩沖液體系，使其更具擴(kuò)增速率快、得率高、特異性強(qiáng)和可信區(qū)間寬的優(yōu)勢(shì)，對(duì)不同豐度、來源的靶基因都極為適用。
產(chǎn)品特色如下：額外添加了藍(lán)色指示劑與黃色樣本稀釋液，將有利于大量樣品的稀釋和加樣，減少操作誤差；Buffer體系中平衡了K+和NH4+的比例，從而增加了擴(kuò)增的可信區(qū)間、穩(wěn)定性和特異性；預(yù)混液中只需加入模板、引物、RNase-Free ddH2O便可進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單方便、快捷；ROX Reference Dye可方便用戶選用針對(duì)不同型號(hào)的熒光定量PCR儀，本品的核心組分能充分消除信號(hào)本底、校正孔、批間差等帶來的熒光信號(hào)誤差。
儲(chǔ)存運(yùn)輸：本品需在-30~-15℃條件下避光保存；運(yùn)輸條件應(yīng)≤0℃。
本品解凍后，可在2~8℃避光條件下穩(wěn)定存放3-6個(gè)月。
注意事項(xiàng)：
（一）實(shí)驗(yàn)前，待使用的2×PreMix和50×ROX Reference Dye請(qǐng)充分解凍。2×PreMix解凍后可能會(huì)出現(xiàn)少許白色沉淀，請(qǐng)室溫放置2min并輕柔顛倒混勻，待溶液成分完全均一后再行使用；
（二）解凍后如未使用，須徹底混勻后重新凍存；非均一的混合液在凍融過程中，會(huì)形成的鹽晶體出現(xiàn)分層、析出現(xiàn)象，對(duì)酶活性造成損害；
（三）PCR反應(yīng)的預(yù)變性條件必須設(shè)定為95℃ 15min，用以充分激活耐熱聚合酶；
（四）PCR反應(yīng)液中各顏色指示劑終濃度應(yīng)為1×，請(qǐng)根據(jù)模板的用量計(jì)算Dilution Buffer的使用量；
（五）20 μl反應(yīng)體系中，建議基因組DNA或cDNA模板使用量≤100ng；逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板時(shí)，使用量應(yīng)≤PCR體系終體積的10%；當(dāng)模板濃度較低時(shí)，可直接用cDNA原液作為模板使用，未稀釋的模板不會(huì)影響定量結(jié)果；
（六）避免反復(fù)凍融；本品含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射；
（七）使用前，可上下顛倒或快速離心以充分混勻試劑，請(qǐng)不要使用渦旋儀避免出現(xiàn)泡沫；
（八）引物終濃度為0.3μM時(shí)，擴(kuò)增效果最為穩(wěn)定；如需要進(jìn)一步優(yōu)化，可以在0.2-0.5μM范圍內(nèi)微調(diào)引物濃度。
實(shí)驗(yàn)流程：
（一）自備產(chǎn)品
RNase-free 1.5ml離心管、PCR管、移液器及吸頭、PCR儀、冰或移動(dòng)冰盒
（二）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1.設(shè)定各相應(yīng)規(guī)格的反應(yīng)體系；
2.解凍模板、引物、2×PreMix、50×ROX Reference Dye、40×Dilution Buffer和RNase-Free ddH2O；并將所有試劑在室溫條件下平衡、混勻。
（三）Real Time PCR反應(yīng)液的配制
1.在qPCR管中配制以下溶液A，冰上操作：
384孔反應(yīng)體系：
| 組分 | 終濃度 | 5 μl體系 | 10 μl體系 | 15 μl體系 | 20 μl體系 |
| 2×PreMix | 1× | 2.5 μl | 5 μl | 7.5 μl | 10 μl |
| 正向引物(10 μM) | 0.3μM◎ | 0.15 μl | 0.3 μl | 0.45 μl | 0.6 μl |
| 反向引物(10 μM) | 0.3μM◎ | 0.15 μl | 0.3 μl | 0.45 μl | 0.6 μl |
| cDNA模板★ | pg~ng | / | / | / | / |
| 50×ROX Reference Dye◆ | / | / | / | / | / |
| RNase-free ddH2O | / | 至5 μl | 至10 μl | 至15 μl | 至20 μl |
| 組分 | 終濃度 | 20μl體系 | 25μl體系 | 50μl體系 |
| 2×PreMix | 1× | 10μl | 12.5μl | 25μl |
| 正向引物(10μM) | 0.3μM◎ | 0.6μl | 0.75μl | 1.5μl |
| 反向引物(10μM) | 0.3μM◎ | 0.6μl | 0.75μl | 1.5μl |
| cDNA模板★ | pg~ng | / | / | / |
| 50×ROX Reference Dye◆ | / | / | / | / |
| RNase-free ddH2O | / | 至20μl | 至25μl | 至50μl |
2.確認(rèn)常見儀器匹配的ROX Reference Dye的濃度
| 儀器 | 終濃度 |
| ABI7500/7500 Fast/ViiA 7;QuantStudio™;12K Flex;Agilent Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 | 1×（如1 μl ROX/50μl體系） |
| ABI 5700/7000/7300/7700/7900HT/StepOneTM/StepOne PlusTM | 1×（如1 μl ROX/50μl體系） |
| Roche儀器;Bio-Rad儀器;Eppendorf儀器等 | 無需添加 |
★將cDNA模板與40×Dilution Buffer按一定比例混合成稀釋模板，使Dilution Buffer在定量體系中的終濃度為1×。
◆常見儀器匹配的ROX Reference Dye的濃度，見上表。
（四）進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)
1.兩步擴(kuò)增法（常規(guī)方法）
| 反應(yīng) | 循環(huán) | 溫度 | 時(shí)間 | 原理 | 熒光信號(hào) |
| 預(yù)變性 | 1× | 95°C | 15min | 預(yù)變性 | 不采集 |
| PCR | 40× | 95°C | 10sec | 變性 | 不采集 |
| 60-66°C♣1 | 20-32sec* | 退火/延伸 | 采集 | ||
| 熔解曲線分析(Melting/Dissociation Curve Stage) | |||||
2.三步擴(kuò)增法（模板濃度和引物Tm值低、非特異擴(kuò)增強(qiáng)、擴(kuò)增曲線重復(fù)性差等時(shí)，可采用該法）
| 反應(yīng) | 循環(huán) | 溫度 | 時(shí)間 | 原理 | 熒光信號(hào) |
| 預(yù)變性 | 1× | 95°C | 15min | 預(yù)變性 | 不采集 |
| PCR | 40× | 95°C | 10sec | 變性 | 不采集 |
| 50-60°C♣2 | 20sec | 退火 | 不采集 | ||
| 72°C | 20-32sec* | 延伸 | 采集 | ||
| 熔解曲線分析(Melting/Dissociation Curve Stage) | |||||
3.請(qǐng)按照儀器使用說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，不同型號(hào)儀器的時(shí)間設(shè)定*如下，
| Roche LightCycler/ LightCycler 480 | 20sec |
| ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7;StepOne/StepOnePlus | 30sec |
| ABI 7000/7300 | 31sec |
| ABI 7500 | 32sec |
♣2 常規(guī)引物退火溫度比引物的解鏈溫度(Tm)低5℃，如引物堿基數(shù)較少，可適當(dāng)提高退火溫度提高PCR特異性；如果堿基數(shù)較多，則可適當(dāng)減低退火溫度。
4.蓋上反應(yīng)管，并瞬時(shí)離心確保組成混勻。
5.將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中，開始反應(yīng)。
常見問題及處理方案：
| 無擴(kuò)增曲線出現(xiàn) |
A．反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠； B．反應(yīng)循環(huán)數(shù)過多，增加背景信號(hào)； C．程序中未設(shè)置信號(hào)采集步驟； D．引物降解； E．模板濃度過低； F．模板降解。 |
| 擴(kuò)增曲線異常 |
A．曲線不光滑：需提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，或確認(rèn)ROX與機(jī)型是否匹配； B．曲線斷裂或下滑：需調(diào)整模板濃度，或減小基線終點(diǎn)，重新分析數(shù)據(jù)； C．曲線驟降：檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡。 |
| CT值異常 |
A．出現(xiàn)太晚 (1)嘗試三步擴(kuò)增法，優(yōu)化反應(yīng)條件或重新設(shè)計(jì)引物，提高擴(kuò)增效率； (2)減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，提高模板濃度； (3)重新制備模板，確認(rèn)模板是否降解； (4)評(píng)估PCR產(chǎn)品是否在80~150bp，防止過長(zhǎng)； (5)加到模板稀釋倍數(shù)，或重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)，防止體系中存在由模板帶入的PCR抑制劑。 B．陰性對(duì)照中出現(xiàn)擴(kuò)增帶 (1)反應(yīng)體系污染； (2)引物二聚體干擾。 |
| 熔解曲線異常 |
A．引物設(shè)計(jì)不適宜； B．引物濃度過高； C．cDNA模板有基因組污染。 |
| 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差 |
A．加樣誤差； B．標(biāo)準(zhǔn)品降解； C．模板濃度不適宜； E．PCR儀模塊內(nèi)置溫度不一致。 |